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內容簡介

《基因操作技術》為國傢示範性高職院校一綫教師和企業專傢共同開發的教改成果教材。《基因操作技術》按照DNA重組技術的操作程序來安排實驗，即從核酸的提取→目的基因的製備→體外DNA的重組(酶切與連接)→重組DNA分子引入受體細胞→轉化子的篩選→重組DNA分子的鑒定等步驟編排成一個綜閤性大實驗。在這個綜閤性實驗中，每一步實驗既相對獨立又與下一步實驗緊密相連。通過這些實驗，學生可以熟練掌握分子生物學最基本的技術，並對DNA重組技術有一個比較全麵而係統的概念。書中同時穿插瞭分子生物學其他必備的實驗，以便培養學生比較全麵的分子生物學實驗技能。《基因操作技術》分為6個項目，每個項目由若乾個任務組成，並且有“必備知識”作為任務的理論補充，“拓展知識”可以擴展學生的知識麵，“項目思考”中設計的問題有助於培養學生獨立思考能力和創新意識。
《基因操作技術》可作為高職高專生物技術相關專業的教材，也可供相關技術人員參考。

內頁插圖

目錄

項目一 質粒pMD18 T EGFP的分離、純化和鑒定
一、項目介紹
二、學習目標
三、項目實施
任務一 創建和諧包容性的工作環境
任務二 清洗、包紮常用玻璃器皿和耗材
任務三 配製並滅菌各種濃度單位的溶液
任務四 創建遺傳信息流示意圖
任務五 堿裂解法分離提取質粒pMD18 T EGFP及濃度測定
任務六 瓊脂糖凝膠電泳鑒定質粒pMD18 T EGFP
任務七 細菌基因組DNA提取及質量檢測
四、項目思考
五、必備知識
（一）基因工程的發展簡史
（二）基因工程實驗規範
（三）溶液濃度的計算與換算
（四）生物學遺傳信息流
（五）DNA的結構
（六）核酸的理化性質
（七）乳糖操縱元
（八）載體（一）
六、拓展知識
（一）基因組大小與基因數量
（二）基因操作對人類生存環境的影響
（三）真核生物DNA的提取
（四）真核基因組DNA的製備技術

項目二 綠色熒光蛋白基因（egfp）轉錄
産物RNA的提取
一、項目介紹
二、學習目標
三、項目實施
任務一 總RNA的提取及含量測定
任務二 mRNA的提取與純化
任務三 RNA瓊脂糖凝膠電泳
任務四 Northern blot
四、項目思考
五、必備知識
（一）RNA操作注意事項
（二）RNA的空間結構和功能
（三）mRNA的閤成與加工
六、拓展知識
（一）植物病毒的RNA提取
（二）動植物組織mRNA提取
（三）兔肝RNA的製備
（四）人體細胞總RNA和mRNA的提取

項目三 體外擴增目的基因——綠色熒光蛋白基因（egfp）
一、項目介紹
二、學習目標
三、項目實施
任務一 以DNA為模闆擴增綠色熒光蛋白基因（egfp）——PCR
任務二 以mRNA為模闆反轉錄擴增綠色熒光蛋白基因——RT�睵CR
任務三 實時熒光係統通過反轉錄定量（RT�瞦PCR）對基因錶達進行分析
任務四 cDNA文庫構建技術（一）——磁珠法提純mRNA
任務五 cDNA文庫構建技術（二）——cDNA鏈的反轉閤成
四、項目思考
五、必備知識
（一）DNA的生物閤成
（二）RNA的生物閤成
（三）DNA聚閤酶的類彆和性質
（四）其他工具酶
（五）PCR技術及其在基因剋隆中的應用
（六）PCR産物的剋隆
六、拓展知識
（一）巢式PCR
（二）cDNA文庫構建技術

項目四 將綠色熒光蛋白基因（egfp）剋隆到載體上
一、項目介紹
二、學習目標
三、項目實施
任務一 利用內切酶對載體和基因（egfp）進行酶切
任務二 酶切片段的脫磷技術
任務三 DNA片段的迴收技術
任務四 基因的重組連接技術
任務五 cDNA文庫構建技術（三）——cDNA的連接、包裝及轉染
任務六 RACE技術擴增構建全長cDNA文庫
四、項目思考
五、必備知識
（一）限製性內切酶分類和催化機製
（二）DNA甲基化酶
（三）DNA連接酶
（四）其他工具酶的催化機製
（五）載體（二）
六、拓展知識
（一）分子標記
（二）RFLP技術
（三）RAPD技術
（四）AFLP技術
（五）SSR技術

項目五 將含有egfp基因的質粒轉化到E.coli中
一、項目介紹
二、學習目標
三、項目實施
任務一 準備溶液及器皿
任務二 感受態細胞的製備及熱激法將質粒轉化到E.coli中
任務三 感受態細胞的製備及電擊法將質粒轉化到E.coli中
任務四 農杆菌轉化植物細胞
任務五 磷酸鈣轉染動物細胞
四、項目思考
五、必備知識
（一）感受態細胞
（二）外源基因導入真核細胞的方法
（三）目的基因的篩選策略
六、拓展知識
（一）基因打靶技術
（二）從基因到基因組

項目六 基因（egfp）及基因産物（EGFP）檢測
一、項目介紹
二、學習目標
三、項目實施
任務一 酶切重組載體鑒定目的基因
任務二 Southern blot
任務三 分子雜交
任務四 DNA測序鑒定目的基因一緻性
任務五 ELISA檢測錶達産物
任務六 SDS�睵AGE檢測蛋白錶達
任務七 Western雜交
任務八 等電聚焦電泳
任務九 蛋白産物的定量測定
四、項目思考
五、必備知識
（一）基因錶達係統
（二）Southern blot
（三）分子雜交技術
（四）DNA測序
（五）報告基因的應用
（六）重組體的篩選與檢測
六、拓展知識
（一）基因芯片
（二）基因治療的基本原理和應用
前景
參考文獻

精彩書摘

（5）玻璃和塑料器皿的乾燥實驗中用到的玻璃和塑料器皿經常需要乾燥，通常都是用烘箱或烘乾機在110～120~C：進行乾燥，而不要用丙酮蕩洗再吹乾的方法來乾燥，因為那樣會有殘留的有機物覆蓋在器皿的內錶麵。硝酸縴維素的塑料離心管加熱時會發生爆炸，所以絕不能放在烘箱中乾燥，隻能用冷風吹乾。2。洗液的配製（1）常用洗液的配製如遇玻璃器皿用上述方法不能洗淨者，可用下列清洗液浸泡後洗刷。因已確定鉻有緻癌作用，因此配製和使用洗液時要極為小心，常用的兩種配製方法如下。
①取100mL工業濃硫酸置於燒杯內，小心加熱，然後慢慢加入5g重鉻酸鉀粉末，邊加邊攪拌，待全部溶解並緩慢冷卻後，儲存在磨口玻璃塞的細口瓶內。
②稱取5g重鉻酸鉀粉末，置於250mL燒杯中，加5mL水使其溶解，然後慢慢加入100mI。濃硫酸，溶液溫度將達80℃，待其冷卻後儲存於磨口玻璃瓶內。
（2）其他洗液
①工業濃鹽酸：可洗去水垢或某些無機鹽沉澱。
②5％草酸溶液：用數滴硫酸酸化，可洗去高錳酸鉀的痕跡。
③5％～10％磷酸三鈉（Na3P04·12H20）溶液：可洗滌油汙物。
④30％硝酸溶液：洗滌二氧化碳測定儀及微量滴管。
⑤5％～10％乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Naz）溶液：加熱煮沸可洗脫玻璃儀器內壁的白色沉澱物。
⑥尿素洗滌液：為蛋白質的良好溶劑，適用於洗滌盛過蛋白質製劑及血樣的容器。
⑦有機溶劑：如丙酮、乙醚、乙醇等可用於洗脫油脂、脂溶性染料汙痕等，二甲苯可洗脫油漆的汙垢。
⑧氫氧化鉀的乙醇溶液和含有高錳酸鉀的氫氧化鈉溶液：這是兩種強堿性的洗滌液，對玻璃儀器的侵蝕性很強，可清除容器內壁汙垢，洗滌時間不宜過長，使用時應小心慎重。
⑨重鉻酸鉀（工業用）80g、粗硫酸100mL、水1000mL配成的洗液：將玻璃器皿浸泡24h後取齣用水衝刷乾淨。清潔液經反復使用變黑，重換新液。此液腐蝕性強，用時切勿觸及皮膚或衣服等，可戴上橡膠手套和穿上橡膠圍裙操作。3。玻璃器皿的包裝（1）培養皿將閤適的底、蓋配對，裝入金屬盒內或用報紙5～8個一摞包成一包。（2）試管、三角燒瓶等於開口處塞上大小適閤的棉塞或紗布塞（也可用各種型號的軟木塞、膠塞等），並在棉塞、瓶口之外，包以牛皮紙，用細繩紮緊即可。製作棉塞時，要求棉花緊貼玻璃壁，沒有皺紋和縫隙，鬆緊適宜。過緊易擠破管口和不易塞入；過鬆易掉落和汙染。棉塞長度不小於管口直徑的2倍，約2／3塞進管口（見圖1-1）。
另一穗比較簡單的棉塞製作方法：取一適當大小紗布，將其中心鋪於管口任其自然下垂至管外壁，將試管上端與紗布一並握住，用一小木棒將紗布中心嚮管內推進，至該棉塞所需長度後握緊試管上端，用木棒將適量棉花嚮管內填塞並壓緊充實後將紗布尾端斂緊，抽齣約1／3長度，散開紗布將棉塞尾部加適量棉花並壓緊使之略大於試管，再斂緊尾部紗布並用棉綫紮緊，剪去多餘綫頭紗布，一大小和鬆緊適宜的棉塞製作完畢（見圖1-2）。
……

前言/序言

21世紀是生物學的世紀，作為生物學最前沿的分子生物學是生物學相關專業的必修課程。隨著人們在分子生物學水平研究的廣泛展開和學習的不斷深入，除瞭在分子水平上瞭解生物的本質特徵外，在分子水平如何進行生物學操作是生物學界共同關心並十分重視的問題。“基因操作技術”就是利用分子生物學的一般原理闡述在分子生物學實驗中所涉及的技術方法、原理和策略，是一門指導分子生物學實驗操作的理論與實踐相結閤的課程。
隨著生物科學和生物技術的日益發展，人們越來越重視對生物學研究手段的瞭解和掌握。新世紀的生物技術專業高職生有必要學習重組DNA技術的原理和方法，學會和掌握重組DNA技術。本書按照重組DNA技術的操作程序來安排實驗，即從核酸的提取→目的基因的製備→體外DNA的重組（酶切與連接）→重組DNA分子引入受體細胞→轉化子的篩選→重組DNA分子的鑒定等步驟編排成一個綜閤性大實驗。在這個綜閤性實驗中，每一步實驗既相對獨立又與下一步實驗緊密相連，隻有獲得前一個步驟的正確實驗結果纔能開始下一個實驗。旨在通過這些實驗，嚮大傢提供分子生物學最基本的技術訓練，掌握最基本、最常用的技術，並對重組DNA技術有一個比較全麵而係統的概念。同時穿插瞭分子生物學其他必備的實驗技能，以便使學生掌握比較全麵的分子生物學實驗技能。
本書分為6個項目，每個項目由若乾個任務組成。在內容編排上，有“必備知識”作為任務的理論補充，“項目思考”中的一些問題由學生獨立思考解決，目的是培養學生的創新意識。項目一和項目二由
張虎成、舒偉和許淑茹撰寫；項目三由舒偉和趙文軍撰寫；項目四由張虎成和楊春花撰寫；項目五和項目六由李建民和魏麗撰寫。本書由張虎成統稿。勞文艷及舒偉在統稿過程中做瞭很多建設性的工作。

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