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本研究旨在明确糖基转移酶BpGT14基因在白桦生长发育中的功能，克隆了白桦GT14基因全长序列和启动子区，分析了其结构特征和表达模式，获得了pRNAi-GG-BpGT14转基因白桦。结果显示：RNAi白桦茎横截面中木质部面积增加了23%～47%，而韧皮部面积比例无明显变化；木质部中导管面积为对照的1.82～2.16倍，韧皮纤维面积比例无明显变化。干扰白桦纤维素含量无明显变化，半纤维素、果胶质含量显著降低，相比野生型分别减少了约40%和10%，说明BpGT14在植物半纤维素、果胶质等细胞壁多糖合成中具有重要作用。 

目录
前言
1 绪论 1
1.1 糖基转移酶简介 1
1.2 糖基转移酶功能 1
1.2.1 植物防御反应 1
1.2.2 植物次生代谢产物修饰 2
1.2.3 植物次生细胞壁合成 2
1.2.4 植物激素平衡 2
1.3 糖基转移酶14研究进展 3
1.3.1 GT14/DUF266（GT14-like）蛋白的鉴定 3
1.3.2 GT14和GT14-like基因系统发育的关系 4
1.3.3 GT14和GT14-like基因的进化 4
1.3.4 GT14和GT14-like基因的表达模式分析 4
1.3.5 GT14蛋白质三维结构及亚细胞定位 9
1.4 植物启动子研究 11
1.4.1 启动子结构及功能 11
1.4.2 启动子克隆方法 11
1.4.3 启动子的应用 12
1.5 转录因子研究 12
1.5.1 转录因子简介 12
1.5.2 转录因子分类及功能 12
1.6 转录因子与启动子互作研究方法 13
1.6.1 酵母单杂交 13
1.6.2 免疫共沉淀 14
1.7 植物DNA甲基化的作用方式及功能 14
1.7.1 植物DNA甲基化的作用方式 14
1.7.2 植物DNA甲基化的功能 15
1.8 木本植物不同发育阶段DNA甲基化水平和模式的变化 16
1.8.1 DNA甲基化与木本植物的年龄 17
1.8.2 DNA甲基化与木本植物的花期、休眠和育性 18
1.9 木本植物离体繁殖过程中的DNA甲基化模式重建 18
1.9.1 组织培养植株与野生植株的DNA甲基化水平和模式差异 19
1.9.2 再生过程、体胚发生、继代培养及外植体状态与DNA甲基化 20
1.10 植物DNA甲基转移酶及与甲基化有关的蛋白质 21
1.10.1 METI家族 21
1.10.2 CMT家族 21
1.10.3 DRM家族 22
1.11 白桦的生物学特性 23
1.12 研究意义 23
2 白桦BpGT14基因及其启动子的克隆及生物信息学分析 25
2.1 实验材料 25
2.1.1 植物材料 25
2.1.2 菌株及载体 25
2.1.3 数据分析 26
2.2 实验方法 26
2.2.1 白桦BpGT14基因生物信息学分析 26
2.2.2 白桦茎段悬浮细胞非生物胁迫处理 26
2.2.3 转录表达定量分析 27
2.2.4 数据处理 27
2.2.5 白桦BpGT14启动子的克隆 27
2.2.6 启动子生物信息学分析 30
2.2.7 植物表达载体的构建 30
2.2.8 植物表达载体农杆菌的转化 32
2.2.9 BpGT14启动子在烟草中的表达活性 33
2.2.10 启动子在白桦细胞中的表达活性 33
2.3 结果与分析 34
2.3.1 白桦BpGT14基因的生物信息学分析 34
2.3.2 白桦BpGT14基因时空特异性表达分析 37
2.3.3 白桦茎段悬浮细胞BpGT14基因非生物胁迫下表达分析 38
2.3.4 白桦BpGT14基因启动子克隆 39
2.3.5 白桦BpGT14基因启动子序列元件分析 40
2.3.6 启动子pXGUS-P及pXGFP-P植物表达载体的构建及鉴定 41
2.3.7 植物表达载体转化农杆菌的鉴定 42
2.3.8 非生物胁迫下启动子在烟草中的表达活性 42
2.3.9 启动子在白桦细胞中的表达活性 43
2.4 讨论 45
2.5 本章小结 49
3 酵母单杂交筛选启动子区及MYBPLANT元件结合候选蛋白 51
3.1 实验材料 51
3.2 实验方法 51
3.2.1 启动子1156bp片段PCR扩增 51
3.2.2 诱饵载体pAbAi线性化及与启动子片段的连接 51
3.2.3 MYBPLANT元件的构建 52
3.2.4 酵母感受态的制备 53
3.2.5 重组诱饵载体pAbAi转化酵母感受态细胞 53
3.2.6 诱饵酵母的鉴定 54
3.2.7 报告基因在诱饵酵母中本底表达水平的测定 54
3.2.8 白桦文库cDNA的合成 55
3.2.9 酵母单杂交文库的构建及筛选 57
3.2.10 阳性克隆菌株的鉴定 58
3.2.11 阳性克隆cDNA插入片段的生物信息学分析 58
3.2.12 启动子候选互作蛋白BpARF2基因的非生物胁迫响应 59
3.3 结果与分析 59
3.3.1 重组诱饵载体的构建 59
3.3.2 重组诱饵质粒转化酵母感受态细胞 59
3.3.3 报告基因在诱饵酵母中本底表达水平的测定 59
3.3.4 白桦文库cDNA的合成 60
3.3.5 酵母单杂交文库的构建及筛选 61
3.3.6 阳性克隆cDNA插入片段的生物信息学分析 61
3.3.7 启动子互作候选蛋白BpARF2基因非生物胁迫响应 64
3.3.8 MYB-pAbAi重组诱饵载体的构建 67
3.3.9 MYBPLANT元件结合候选蛋白的筛选 68
3.4 讨论 68
3.5 本章小结 70
4 启动子MYBPLANT元件结合候选蛋白的鉴定 72
4.1 实验材料 72
4.2 实验方法 72
4.2.1 候选蛋白互作强弱初步鉴定 72
4.2.2 白桦BpAL4基因的克隆 72
4.2.3 白桦BpAL4基因生物信息学分析 74
4.2.4 候选蛋白互作强弱初步鉴定 74
4.2.5 三次重复元件pCXGUS植物表达载体构建 76
4.2.6 三亲杂交及农杆菌的遗传转化 77
4.2.7 烟草中GUS基因表达水平鉴定 78
4.2.8 非生物胁迫下白桦BpAL4基因表达水平鉴定 78
4.3 结果与分析 78
4.3.1 候选蛋白互作强弱鉴定 78
4.3.2 白桦BpAL4基因的克隆 79
4.3.3 白桦BpAL4基因生物信息学分析 79
4.3.4 白桦BpAL4基因植物表达载体的构建 82
4.3.5 三次重复元件pCXGUS植物表达载体构建 83
4.3.6 BpAL4蛋白及MYBPLANT元件共转化分析 84
4.4 讨论 85
4.5 本章小结 87
5 白桦BpGT14基因表达载体及RNA干扰载体的构建及遗传转化 88
5.1 实验材料 88
5.2 实验方法 88
5.2.1 白桦总RNA的提取与cDNA的合成 88
5.2.2 白桦BpGT14基因pMD18-T载体的构建 88
5.2.3 白桦BpGT14基因干扰载体的构建 89
5.2.4 三亲杂交法转化根癌农杆菌 89
5.2.5 根癌农杆菌介导的白桦遗传转化 90
5.2.6 转基因植株的分子鉴定 91
5.2.7 转基因白桦组培苗的移栽 92
5.2.8 石蜡切片 92
5.2.9 转基因白桦木质素、纤维素、半纤维素和果胶的测定 93
5.3 结果与分析 96
5.3.1 白桦BpGT14基因pMD18-T载体的构建 96
5.3.2 白桦BpGT14基因干扰载体的构建 97
5.3.3 三亲杂交 97
5.3.4 转基因植株的获得 98
5.3.5 转基因植株的分子鉴定 98
5.3.6 RNAi白桦茎段结构分析 99
5.3.7 BpGT14-RNAi转基因白桦细胞壁成分分析 101
5.4 讨论 103
5.5 本章小结 106
6 白桦微繁过程中BpGT14表达及DNA甲基化的变异机制 108
6.1 实验材料 108
6.1.1 植物材料 108
6.1.2 实验器材 108
6.2 实验方法 108
6.2.1 培养基及培养条件 108
6.2.2 外植体选取与消毒 109
6.2.3 腋芽增殖的继代培养 109
6.2.4 愈伤组织的诱导及分化 109
6.2.5 再生植株生根及移栽 109
6.2.6 酶液制取 109
6.2.7 保护酶活性的测定 109
6.2.8 木质素测定 111
6.2.9 丙二醛含量测定 111
6.2.10 可溶性糖含量测定 111
6.2.11 可溶性蛋白含量测定 112
6.2.12 白桦DNA提取及亚硫酸盐处理 112
6.2.13 BpGT14及甲基转移酶基因表达量分析 113
6.2.14 数据处理 115
6.3 结果与分析 115
6.3.1 愈伤组织的诱导和分化 115
6.3.2 甲基转移酶基因的表达 115
6.3.3 甲基转移酶的活性分析 116
6.3.4 5′-CCGG的胞嘧啶甲基化水平 118
6.3.5 再生不同阶段细胞氧化还原水平 120
6.3.6 再生不同阶段变异的主成分分析 120
6.3.7 愈伤再生不同发育阶段BpGT14基因表达分析 124
6.3.8 白桦BpGT14基因内含子生物信息学分析 124
6.3.9 愈伤再生不同发育阶段BpGT14基因启动子及编码区DNA甲基化变异 128
6.4 讨论 131
6.4.1 甲基转移酶基因在再生过程中的表达 131
6.4.2 白桦组织培养中DNA甲基化的变化 131
6.4.3 微繁殖过程中的生理变化 132
6.4.4 不同发育阶段的表观遗传参数和生理指标的变化 133
6.4.5 愈伤再生不同发育阶段BpGT14基因启动子及编码区DNA甲基化变异 133
6.5 本章小结 134
7 展望 136
参考文献 137





1 绪论
　　1.1 糖基转移酶简介
　　糖基转移酶（glycosyltransferase，GT）是一个重要的功能多样化酶家族，与多糖和糖苷的合成密切相关。植物逐渐进化形成了GT大家族，这个大家族在植物的生长和发育过程中催化糖基化的一系列反应（Lao et al.，2014）。根据Carbohydrate-Active enZYmes（CAZy）数据库，模式植物拟南芥基因组中编码了超过450个糖基转移酶，而水稻基因组包含600个成员（Coutinho et al.，2003）。
　　糖基转移酶（GT；EC 2.4.x.y）可以催化活性糖基从供体分子转移到受体分子，如糖类、核酸、脂质、蛋白质及各式各样的有机化合物（VoGTand Jones，2000）。糖基转移酶一般在C 端保守，C端被普遍认为是识别糖基的区域，而N 端因其不保守性则被认为是底物的识别位点（Lairson et al.，2008）。糖基化对于生物体是一个关键的反应，到目前为止，CAZy数据库定义了超过97个GT家族（http：//www.cazy.org/）。复杂的碳水化合物的合成在植物体内尤为重要，这些物质控制植物体内各种分子功能、细胞与细胞的相互作用、信号及蛋白糖基化（Yonekura-Sakakibara and Hanada，2011）。寡糖和多糖的合成涉及几百种不同的糖基转移酶，它们可以将糖基从活化的供体分子转移到受体，糖基化特异性的目标分子（Breton et al.，2006）。因此，所有这些糖基转移酶家族在植物细胞的结构和功能方面均扮演着重要角色。
　　1.2 糖基转移酶功能
　　1.2.1 植物防御反应
　　植物小分子糖基化对植物耐受逆境有着重要意义。拟南芥中一种糖基转移酶UGT73B2被证明与植物氧化胁迫抗性有关（Kim et al.，2010），烟草中的一种糖基转移酶能够糖基化羟基香豆素、羟基甲氧基香豆素和羟基肉桂酸，并且在超敏反应中，水杨酸能够上调其表达（Fraissinet-Tachet et al.，1998）。同时有研究发现，在拟南芥中过表达UGT74E2糖基转移酶基因会使植物的抗旱及抗盐性增强（Tognetti et al.，2010）。尽管已有研究表明了糖基转移酶基因与植物逆境胁迫相关，但其中的具体机制目前尚不清楚。
　　1.2.2 植物次生代谢产物修饰
　　植物次生代谢产物对植物的生长发育具有重要的作用，而糖基化对于次生代谢产物的形成有着关键意义。大量的次生代谢产物具有多种糖型，这些糖型可以影响它们的物理和化学特性（周文灵等，2009）。目前，已经发现大量参与次生代谢物形成的糖基转移酶。拟南芥中，两个糖基转移酶基因UGT73C6和UGT78D1被发现与黄酮醇糖苷物的生物合成相关（Jones et al.，2003）。甜叶菊的叶子中有大量双萜化合物积累，而这些化合物不同位置的糖基化导致了其口感的不同（Richman et al.，2005）。同时有研究表明，部分糖基转移酶在植物苯丙烷途径中扮演着重要的角色，它们可以通过糖基化改变分子的水溶性等各种特征，起到调控作用（王会勇，2013）。植物木质素的合成前体为苯丙烷衍生物，这意味着糖基转移酶对植物木质素的合成具有重要调控作用。
　　1.2.3 植物次生细胞壁合成
　　细胞壁的成分中，90%左右是多糖，主要为纤维素、半纤维素和果胶类，糖基转移酶参与细胞壁组分（纤维素、半纤维素和果胶）的合成，催化各种分子的糖基化，因此对植物细胞壁的发育有着重要影响（Doblin et al.，2010；Sado et al.，2009）。GT家族在植物中的重要功能为参与植物细胞壁多糖的合成。细胞壁中*丰富的多糖是纤维素，一种线性聚合物，可以通过纤维素合酶GT2家族成员（CESA）在质膜中合成（Liu et al.，2012）。多糖是具有分支的结构体，在高尔基体通过编码合成大量GT家族成员后分泌到细胞壁形成弯曲交联结构。蛋白质的糖基化发生在内质网和高尔基体，这是翻译后修饰的一个*普遍体现（Yang et al.，2013a）。目前，对杨树中糖基转移酶的研究较为广泛，对其转录图谱进行分析发现，多个基因对植物次生细胞壁具有重要作用，同时分析发现，糖基转移酶在杨树木质部中参与了碳水化合物的合成和重构，进而直接影响木质部的发育（Williamson et al.，2002）。
　　1.2.4 植物激素平衡
　　植物体内的激素水平平衡对于植物的生长发育及对外界环境的响应具有重要的意义（王军和侯丙凯，2008）。目前在植物体内，众多激素的糖苷物均已被发现，这表明激素的糖基化对于体内激素的调节有着重要的意义（Woodward and Bartel，2005）。目前认为，糖基化可以使激素活性降低或者消失（王军和侯丙凯，2008）。拟南芥中对于UGT84B1 基因的过表达植株研究表明，该基因可导致植株生长素缺失（Jackson et al.，2002），而赤豆中的一个脱落酸糖基转移酶体外研究表明，该基因产物可以使反式脱落酸糖基化（Xu et al.，2002）。目前，在烟草中，对水杨酸的糖基化研究较为全面，同时拟南芥中也发现了水杨酸诱导的糖基转移酶（王军和侯丙凯，2008）。
　　1.3 糖基转移酶14 研究进展
　　糖基转移酶14 家族属于糖基转移酶超家族，该家族在植物细胞壁合成中扮演着重要角色（Richmond，2000）。对于生物乙醇的生产，细胞壁是*丰富的纤维素生物质来源，因此对糖基转移酶14 调控细胞壁生长发育的研究，对于生物能源的开发具有重要的研究意义（Cao et al.，2008）。在拟南芥、水稻、杨树、高粱和葡萄中（表1-1），共鉴定了62个GT14基因和106个DUF266基因（目前有假设称，DUF266 蛋白是一个新的GT分类，与GT相关，命名为GT14-like）（Yang et al.，2008）。对于这些GT14基因的系统发育分析将GT14和GT14-like基因分到了两个不同的类别，但蛋白结构域、3D构型和基因表达分析揭露出两个类别均属于一个家族，因此，将其命名为GT14/GT14-like家族，包括两个亚家族（Ye et al.，2011）。
　　表1-1 不同物种中GT14和GT14-like基因数目
　　在拟南芥和杨树中，一半的GT14/GT14-like基因在茎和木质部优先表达，暗示其在细胞壁合成中的重要作用（Yang et al.，2013a）。AtGLCAT14A是拟南芥GT14家族的一个蛋白质，拟南芥中有11个蛋白质属于这个家族，敲除该基因的突变体幼苗的胚轴和根的生长率提高，表明该基因可能与细胞伸长相关（Liu et al.，2012）。
　　1.3.1 GT14/DUF266（GT14-like）蛋白的鉴定
　　为了验证GT14和DUF266（GT14-like）蛋白是属于同一个具有特殊支链蛋白结构域家族的假说，作者用HMMER-InterProScan 的方法在5个已测序的植物物种中获得了所有含有支链结构域的蛋白质序列（Yang et al.，2008）。5个已测序的植物物种包括一年生拟南芥（双子叶植物）、水稻（单子叶植物）、杨树（多年生双子叶植物）、高粱（单子叶植物）和葡萄（多年生双子叶植物），该研究共鉴定出168个含有支链结构域的非冗余的全长蛋白质序列，其中拟南芥中有33个、水稻中有31个、杨树中有44个、高粱中有34个、葡萄中有26个。蛋白质序列的长度为75～651个氨基酸，平均长度为376个氨基酸。用HMMERInterProScan的方法所得到的蛋白质包含CAZy数据库中11个拟南芥GT14家族的蛋白质和水稻GT数据库中12个GT14家族的蛋白质，这表明基因筛选的方法是有效的。
　　1.3.2 GT14和GT14-like基因系统发育的关系
　　对获得的168个含有支链蛋白结构域的全长蛋白质序列构建系统进化树，结果如图1-1A所示，这168个蛋白质主要被分成两个进化枝，分别被命名为GT14和GT14-like。GT14-like蛋白先前被称为DUF266蛋白，可被分成5 组（A1～A5），GT14蛋白可被分成8组（B1～B8）。用InterProScan软件对这168个GT14和GT14-like的蛋白质序列进行功能分析（Hunter et al.，2009），共鉴定出3个蛋白结构域：核心-2/1-分支酶功能域（IPR021141），GT14结构域（IPR003406），以及一个钙离子结合位点结构域（IPR018247）。如图1-1B 所示，这三种结构域组成两种类型的域结构，第*种类型是只含有支链结构域，第二种类型是既含有支链结构域又含有GT14结构域。GT14蛋白的系统发育的进化枝只包含第二种类型的域结构，GT14-like蛋白

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