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内容简介

《生物化学与分子生物学实验技术》一书对实验安全知识和生物大分子的制备作了全面扼要的介绍，并着重介绍了常用生物化学和生物大分子学实现技术,共十七章。内容包括光谱分析技术、色谱技术、膜分离技术、离心技术、电泳技术、核酸操作技术、基因文库技术、聚合酶链式反应扩增技术、重组DNA技术、外源基因表达技术、基因沉默技术、DNA序列测定技术、分子杂交技术和生物芯片技术的基本原理和实验方法，同时对生物信息学技术进行了简明扼要的介绍。
《生物化学与分子生物学实验技术》可作为高等院校生物工程、生物技术、食品科学与工程、生物制药、动物医学、动物科学、发酵工程、卫生检验和医学等专业的教材，也可供相关专业的学生、教师和科研工作者参考。

作者简介

蔡勇，西北民族大学生命科学与工程学院，实验室主任、副教授、硕导，主要教学经历
2005.7—— 担任动物医学本科专业、动物科学本科专业的《动物生物化学》课程
2007.1—— 担任生物工程本科专业、生物技术本科专业的《生物化学》课程
2009.1—— 担任基础兽医、预防兽医、临床兽医、动物遗传育种与繁殖、动物营养和特种经济动物养殖硕士研究生的《高级生物化学》课程
科学研究、实践经历
自2005年工作以来，一直从事生物化学与分子生物学的教学与科研工作，先后承担西北民族大学教改项目2项；主持或参与国家自然科学基金、甘肃省科技支撑计划、甘肃省农牧厅生物技术专项、兰州市科技计划项目和中央高校基本业务费科研项目等15项，获甘肃省高校科技进步一等奖1项，甘肃省科技进步三等奖1项。

目录

第一章生物化学及分子生物学实验基本操作技术
第一节生物化学及分子生物学实验技术发展简史1
一、生物科学发展简史1
二、生物化学发展简史3
三、我国生物化学的发展4
第二节实验室规则及安全防护4
一、实验室规则4
二、有害化学物的处理5
三、实验室安全及防护知识6
第三节常用器皿的使用10
一、常用玻璃量器的规格10
二、常用器皿的清洗10
三、玻璃仪器的干燥11
四、清洗液的种类及配制11
五、玻璃仪器的使用12
六、常用玻璃量器的校正12
第四节移液器的种类和使用13
一、滴管13
二、吸量管13
三、微量进样器15
四、自动移液器16
第五节溶液的混匀17
一、搅拌法17
二、旋转法18
三、弹打法18
四、离心法18
五、吹打法18
六、涡旋法18
七、振荡器混匀法19
第二章生物大分子制备技术
第一节生物材料的选择与采集20
一、生物材料的选取20
二、生物材料的采集与保存20
三、生物材料的预处理21
第二节组织及细胞的破碎23
一、机械破碎法23
二、物理破碎法24
三、化学破碎法25
四、酶学破碎法25
第三节生物大分子的提取26
一、活性物质的保护措施26
二、影响提取的因素27
第四节生物大分子的分离、纯化和定量29
一、分离纯化原理29
二、分离纯化方法的选择与分离程序30
三、目标物质初分离30
四、目标物质的纯化与纯度鉴定31
第五节浓缩、干燥及保存33
一、制品的浓缩33
二、制品的干燥33
三、制品的保存34
第三章光谱分析技术
第一节紫外-可见吸收光谱分析35
一、光谱产生的过程35
二、光谱的分类36
三、常用吸收光谱分析术语37
四、朗伯-比尔定律39
五、紫外-可见分光光度计的基本构造39
六、紫外-可见分光光度计的分类41
七、紫外-可见吸收光谱分析方法41
八、紫外-可见吸收光谱分析的影响因素44
九、可见光比色分析条件的选择46
第二节荧光光谱分析技术47
一、荧光分析的基本原理47
二、相关概念和参数47
三、荧光仪器的基本结构及光电系统48
四、荧光分析的应用49
第三节原子吸收光谱分析技术51
一、原子吸收分光光度计的原理51
二、原子吸收光谱的产生51
三、基态原子数和激发态原子数的关系52
四、待测元素的定量52
五、原子吸收光谱分析的优点52
第四章色谱技术
第一节色谱技术分类53
一、按固定相和流动相所处的状态分类53
二、按色谱分离原理分类54
三、按实验技术分类54
四、根据操作方式分类55
第二节层析的基本理论55
一、分配系数56
二、阻滞因数或Rf57
三、洗脱体积Ve57
四、色谱法的塔板理论57
五、色谱图59
六、分离度60
七、色带的变形和“拖尾”61
第三节柱色谱系统基本操作方法62
一、装柱62
二、平衡63
三、上样量和上样体积63
四、洗脱64
五、流速及控制65
六、分部收集66
七、检测和合并收集66
八、洗脱峰的纯度鉴定66
九、脱盐和浓缩67
第四节常用的色谱方法67
一、吸附色谱法67
二、分配色谱法73
三、凝胶色谱法76
四、离子交换色谱法79
五、亲和色谱技术84
六、薄层色谱法88
七、气相色谱99
八、高效液相色谱102
第五章膜分离技术
第一节过滤109
一、过滤的分类110
二、过滤装置110
三、过滤的操作过程111
第二节半透膜分离技术111
一、膜分离技术概况111
二、膜分离技术基本原理112
三、膜的性质112
四、分离方式112
五、透析袋的处理、保存113
第三节微滤114
一、微滤的基本概念和分离范围114
二、微滤的操作模式114
第四节超滤技术115
一、超滤装置与工作原理115
二、影响超滤的几个因素117
三、超滤技术的应用117
第六章离心技术
第一节离心技术基本原理118
一、离心力和相对离心力118
二、沉降速度120
三、沉降系数120
四、离心时间120
第二节离心机的主要构造和分类120
一、制备型离心机121
二、分析型离心机123
第三节离心的基本方法123
一、沉淀离心124
二、差速沉降离心法124
三、密度梯度区带离心法124
四、连续流离心126
五、分析超离心126
第四节离心操作注意事项127
第七章电泳技术
第一节电泳技术概况及基本原理128
一、电泳技术发展简史128
二、电荷的来源129
三、泳动度129
四、影响电泳的因素130
五、电泳的分类131
第二节纸电泳132
第三节醋酸纤维素薄膜电泳132
一、原理及特点132
二、操作要点133
三、应用133
第四节琼脂糖凝胶电泳133
一、琼脂糖凝胶的特点133
二、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系134
三、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系134
四、琼脂糖凝胶电泳基本方法简介134
第五节聚丙烯酰胺凝胶电泳135
一、聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性135
二、常规聚丙烯酰胺凝胶电泳137
三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳140
四、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳141
五、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳143
六、聚丙烯酰胺凝胶双向电泳148
第六节染色方法151
一、蛋白质染色151
二、糖蛋白染色153
三、脂蛋白染色154
四、核酸染色154
五、同工酶染色156
第七节毛细管电泳157
一、毛细管电泳的基本原理157
二、毛细管电泳的类型158
三、毛细管电泳装置159
四、几种毛细管电泳分离模式的基本原理160
五、毛细管等速电泳162
第八节其他电泳技术163
一、免疫电泳163
二、单细胞电泳165
三、脉冲凝胶电泳165
四、印迹转移电泳166
五、温度梯度凝胶电泳166
六、逆向色谱电泳166
七、介体电泳167
第八章核酸操作基本技术
第一节核酸的提取与纯化168
一、基本原理168
二、微生物DNA的提取169
三、动物细胞DNA的提取172
四、植物细胞核DNA的提取173
五、核外DNA的提取175
六、RNA的提取177
第二节核酸的检测与保存180
一、核酸的检测180
二、核酸的保存182
第三节核酸的凝胶电泳183
一、琼脂糖凝胶电泳183
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳185
第九章基因文库技术
第一节基因组文库的构建186
一、载体的选择187
二、基因组DNA的制备187
三、基因组DNA的处理187
四、载体与外源DNA的连接188
五、重组DNA的体外包装和转入宿主细胞188
六、文库的检测、扩增和保存188
第二节cDNA文库的构建189
一、cDNA文库构建的基本原理与方法189
二、cDNA全长文库189
三、cDNA文库质量评价190
四、cDNA文库的其他类型191
第三节基因文库的扩增和保存192
第四节克隆基因的分离与鉴定193
一、通过重组体表型特征进行筛选鉴定193
二、通过重组DNA分子结构特征进行筛选鉴定194
三、通过外源基因的表达产物进行筛选鉴定194
四、cDNA文库分离新基因的方法195
第十章聚合酶链式反应扩增技术
第一节聚合酶链式反应扩增原理197
第二节PCR反应体系198
一、引物198
二、底物（dNTP）199
三、模板199
四、Taq DNA聚合酶199
五、PCR缓冲液200
六、镁离子200
第三节PCR反应条件的选择200
一、温度循环参数200
二、PCR反应动力学201
第四节PCR引物及其设计201
一、PCR引物设计的基本原理201
二、引物设计软件203
第五节常用的PCR方法203
一、原位PCR203
二、逆转录PCR204
三、实时定量PCR206
四、甲基化PCR207
五、巢式PCR208
第六节PCR技术的应用209
一、核酸的基础研究209
二、序列分析210
三、检测基因表达210
四、从cDNA库中放大特定序列210
五、研究已知片段邻近基因或未知DNA片段210
六、进化分析210
七、医学应用211
八、分析生物学证据211
九、性别控制211
十、转基因检测211
第十一章重组DNA技术
第一节分子克隆常用的工具酶213
一、限制性核酸内切酶214
二、DNA聚合酶215
三、DNA连接酶216
四、核酸酶217
五、碱性磷酸酶220
第二节目的基因的获取221
一、直接从染色体中分离221
二、聚合酶链式反应（PCR）扩增基因221
三、通过mRNA合成cDNA221
四、人工体外合成DNA片段222
第三节载体222
一、组成载体的元件223
二、载体的分类223
三、几种常用的载体224
第四节DNA分子的体外连接229
一、全同源黏性末端的连接229
二、平头末端连接229
三、定向克隆229
四、利用连接子连接229
五、利用适配子连接230
第五节宿主细胞230
一、原核细胞E�眂oli230
二、真核细胞230
三、模式植物——拟南芥231
第六节外源基因导入宿主细胞231
第七节重组子的鉴定和外源基因的表达232
一、重组子的鉴定232
二、外源基因的表达233
第十二章外源基因表达技术
第一节基因表达的调控元件234
第二节外源基因在宿主细胞中的高效表达235
一、有效的转录起始与基因的高效表达235
二、mRNA的有效延伸和转录终止与基因的高效表达237
三、mRNA的稳定性与基因的高效表达237
四、有效的翻译起始与基因的高效表达237
五、遗传密码应用的偏倚性与基因的高效表达239
六、mRNA的二级结构与基因的高效表达243
七、RNA的加工与基因的高效表达243
八、mRNA序列上终止密码子的选择243
九、表达质粒（或载体）的拷贝数及稳定性与基因的高效表达243
十、外源蛋白质的稳定性与基因的高效表达244
第三节基因的融合和融合蛋白的表达244
一、利用基因融合技术表达外源基因的优势244
二、基因融合的策略245
三、基因融合和重组蛋白的产生246
四、基因融合和展示筛选247
五、基因融合和蛋白分泌248
六、融合蛋白的纯化248
七、融合蛋白的位点特异性切割249
第四节外源基因的分泌表达249
一、外源基因在E�眂oli细胞中的分泌表达250
二、外源基因在枯草杆菌中的分泌表达251
三、α-因子前导序列介导的酵母细胞分泌系统252
四、外源基因在哺乳动物细胞中的分泌表达255
第十三章基因沉默技术
第一节基因沉默的机制258
一、转录水平上的基因沉默258
二、转录后的基因沉默259
第二节RNA干扰260
一、概述260
二、RNAi的可能作用机制260
三、RNAi的作用特点261
四、RNAi的研究方法262
第三节基因沉默的特点及其应用265
一、基因沉默是获得性免疫的新途径265
二、基因沉默的克服技术265
三、基因沉默的应用266
第十四章DNA序列测定技术
第一节Sanger双脱氧链终止测序法270
一、Sanger双脱氧链终止法的原理270
二、Sanger双脱氧末端终止测序法技术272
三、PCR-Sanger测序法274
第二节Maxam-Gilbert DNA化学降解测序法274
第三节新一代高通量测序技术275
一、新一代测序技术简介275
二、新一代测序技术带来的技术变化277
三、高通量测序技术在动植物研究领域中的应用278
四、新一代高通量RNA测序数据的
处理与分析291
第十五章分子杂交技术
第一节分子杂交的发展及其分类301
一、分子杂交技术的发展历程301
二、分子杂交的种类301
三、分子杂交的技术路线302
第二节探针的制备302
一、探针的种类302
二、标记物的选择303
三、探针的放射性同位素标记306
四、探针的非放射性标记307
五、膜上印迹杂交的条件选择307
六、杂交信号的检测309
第三节Southern印迹310
第四节Northern印迹311
第五节Western印迹312
一、Western blot印迹方法313
二、固定化膜的种类314
三、电泳转移314
四、封闭315
五、探针杂交315
六、显色316
七、结果分析316
八、抗血清的制备317
第十六章生物芯片技术
第一节生物芯片简介323
一、生物芯片简介323
二、生物芯片的种类323
第二节基因芯片的基本原理和基本流程325
一、基因芯片的基本原理325
二、基因芯片的基本流程325
第三节生物芯片的应用329
一、基于芯片的序列分析329
二、基于芯片的基因功能分析332
三、基因诊断334
四、药物筛选334
第四节生物芯片的数据处理和分析334
一、数据处理334
二、数据分析335
第十七章生物信息学技术
第一节生物信息学概况341
一、生物信息学的产生和发展341
二、生物信息学的研究内容341
第二节生物信息数据库342
一、核酸数据库343
二、蛋白质数据库345
三、其他数据库资源348
第三节序列比对和数据库搜索348
一、序列两两比对348
二、多序列比对351
三、核酸与蛋白质结构和功能的预测分析351
第四节生物信息学的应用356
一、生物信息学在作物抗性研究中的应用356
二、生物信息学与人类基因组计划358
参考文献

精彩书摘

第十三章 基因沉默技术
基因沉默（gene silencing）是指生物体特定基因由于某种原因丧失表达的现象。发生沉默的基因可以是外源转移基因，也可以是入侵病毒甚至是宿主的内源基因。研究表明，环境因子、发育因子、DNA修饰、组蛋白乙酰化程度、基因拷贝数、位置效应、生物的保护性限制修饰以及基因的过度转录等都与基因沉默有关。基因沉默一般有两种情况，一种是转录水平上的基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS），即由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的基因沉默。另一种是转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS），即在转录后通过对目标RNA进行特异性降解而使基因沉默。转基因沉默就是外源导入并整合进受体基因组中的外源基因在当代转化体或其后代中的表达受到抑制而不表达的现象。转基因沉默是目前动物基因工程技术实现商业化的大障碍。
基因工程技术的内涵不仅仅是基因的转移和获得特异性蛋白质的表达，抑制或消除生物体基因组内某些基因的表达也是遗传工程技术的另外一个内涵。消除或抑制基因表达的基因工程技术叫做基因沉默（gene silencing）技术。基因的沉默就是基因表达的抑制或消除。基因沉默技术就是通过构建反义基因（antisense gene）或有义基因（sense gene）来阻止蛋白质的合成。实现基因沉默有两种方法，一种是阻止mRNA的合成，另一种就是使mRNA在到达核糖体之前失效，这两种方法都可阻止蛋白质的合成，从而消除该基因的表达，实现基因沉默。
有义基因具有与靶细胞基因相同的编码序列，它是由从靶细胞中获得的mRNA通过反转录酶催化反转录而产生的。将有义基因做一些小的改变，加载到侵染体上，然后进行转移就可以达到沉默基因的目的。目前，通过转移有义基因来实现基因沉默的技术尚不完善。其有效性取决于有义基因在靶细胞基因组中所嵌入的位置。有义基因抑制源生基因的机理目前尚不清楚。
反义基因的核酸序列和靶细胞中内源基因的序列是互补的，反义基因可由DNA合成仪合成，加载到侵染体上后转移到靶细胞中去。被转移的反义基因开始转录mRNA，而此时所转录的mRNA是内源基因转录的mRNA的互补链，因此内源基因转录的mRNA就被混合或杂交了，杂交后的mRNA失去了正常的功能，不能指导合成原来的蛋白质，从而阻止了原性状的表达，实现了基因沉默。
基因沉默技术在植物中首先应用在番茄上，其效能是通过基因沉默增加番茄硬度从而延长存放时间。实现这一目的的技术就是基因沉默技术。具体的原理是利用基因沉默技术消除或抑制控制番茄熟化反应的酶的基因，减少该酶的分泌，从而延长熟化过程，达到延长保存时间的目的。利用该技术已经成功培育出了存放时间较长的番茄品种。另外，利用基因沉默延缓熟化过程的技术已在其他水果和蔬菜品种的培育上广泛使用，并取得了积极的效果。基因沉默技术还可应用于医学领域，利用此技术可消除某些致病基因，还可关闭某些基因的表达，如致癌基因、艾滋病病毒基

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